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技術文章   Article

96-1磁力攪拌器 在石蠟切片法實驗中的應用簡介

點擊次數:5491 更新時間:2014-04-09

 一、目的要求:簡要介紹石蠟切片的制作和蘇木精、 曙紅染色法(簡稱H.E染色法),

  借以了解石蠟切片制作的基本原理和一般方法。

  二、實驗用具:解剖器一套、單面刀片、切片刀、切片機、載玻片、蓋玻片、標本瓶、燒杯、量筒、漏斗、染色缸、樹膠瓶、酒精燈、毛筆、繪圖紙、濾紙、熔蠟箱(或恒溫箱)、展片臺(或燙板)、小木塊、蠟帶盒、烤片盒、切片托盤。

  三、實驗材料:蛙或小白鼠。

  四、實驗內容:

  (一)藥品:

  1、70%、80%、90%、95%酒精及*:

  95%以下的各級濃度酒精是用95%酒精加 蒸餾 水稀釋而成。簡單的稀釋方法:所需稀釋的濃度是多少,就量取多少毫升原濃度的酒精,再加 蒸餾 水至該酒精的原濃度即可。例如,配制70%酒精,就量取70ml95%酒精,然后加入25ml蒸餾水即成。

  2、固定液:

  常用的固定液有10%福爾馬林、Bouin氏液和Zenker氏液等。Bouin氏液在組織學切片技術方面應用甚廣,配方如下:

  苦味酸飽和水溶液 75ml

  福爾馬林    25ml

  冰醋酸    5ml

  3、蛋白甘油:

  蛋白甘油是粘貼蠟片用的粘片劑。配方如下:取一新鮮雞蛋的蛋白,充分攪拌成雪花狀泡沫,然后濾去泡沫,加入等量甘油,使用磁力攪拌器攪拌均勻,再加入一小粒麝香草酚防腐。因甘油粘度較大 所以須用大功率的磁力攪拌器。梅穎浦的96-1大功率磁力攪拌器非合適本實驗。

  4、染色液:

  以H.E.染色法為例,需配制蘇木精染液和曙紅染液。

  ⑴、蘇木精染液:蘇木精是一種堿性染料,它可將染色質染成藍紫色。配方有多種,現介紹Harris氏蘇木精的配制:

  甲液: 蘇木精     0.5 g

  95%酒精     5.0 ml

  乙液: 硫酸鋁鉀(或硫酸鋁銨) 10g

  蒸餾水     100 ml

      0.25g

  冰醋酸     幾滴

  先將甲液溶解,再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水中,并加熱使溶解,然后將兩液混合煮沸,離開火焰后緩緩加入。冷卻后過濾,加入幾滴冰醋酸即成。

  ⑵、0.5%曙紅酒精溶液:即0.5g曙紅溶于100ml95%酒精中。 曙紅是一種酸性染料,它可使多種細胞的細胞質染成粉紅色或紅色。

  5、鹽酸酒精:

  鹽酸酒精用于分色。配制方法是在100ml70%酒精中加入1ml鹽酸。

  6、其它:

  二甲苯、切片石蠟、中性樹膠等。

  (二)、操作步驟:

  進行組織學研究,必須把活的組織或器官制作成切片標本,以便在顯微鏡下進行觀察。切片標本也就是利用組織的不同結構,經過染色后呈現出不同的顏色和不同的折光率而制作的。制片的方法眾多,但基本要求是盡量保持結構的真相,切成薄的切片,應用不同的染色方法,使內部結構清晰易見。

  石蠟切片法是zui常用的一種制片法。其制作過程是:取材→固定→沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→烤片→脫蠟→復水→染色→脫水→透明→封藏。現分述如下:

  1、取材和固定:

  固定的目的在于保存組織內細胞原有的結構和形態,使其與生活時相似,因此要求固定的材料越新鮮越好。把動物殺死后應立即割取組織塊,并快速投入固定液中。

  將蛙或小白鼠快速剪去頭部,打開腹腔,用銳利的刀片割取小塊組織(肝、腸等)。 組織塊的大小以厚度不超過5mm 為宜。 然后, 將取下的組織塊迅速投入Bouin氏固定液中。固定時間為數小時至24小時(需視組織塊的大小而定)。

  2、沖洗:

  經固定的材料,可根據不同的固定液,分別用水或酒精沖洗,以洗去固定液,否則固定液留在組織會有礙染色.

  用Bouin氏液固定的材料,可直接移入70%酒精中,多換幾次酒精,直至無黃色時為止。也可在酒精中加入幾滴氨水或飽和碳酸鋰溶液,以迅速洗去黃色。但留少許黃色也無妨礙。

  浸洗后的材料若暫時不制片,可保存于70%酒精中。

  3、脫水:

  柔軟并含有多量水分的組織是易切成薄片的,故必須增加組織的硬度。石蠟切片法就是使石蠟滲入組織,以達到支持增硬的作用。但水與石蠟是不相混合的,因此,在浸蠟、包埋前須將組織中的水分*除去,這一步驟即為脫水。

  常用的脫水劑是酒精。脫水時,先從低濃度的酒精開始,然后,遞增濃度,直至*。具體方法是,將材料經70%酒精→80%酒精→95%酒精(Ⅰ)→95%酒精(Ⅱ)→*(Ⅰ)→*(Ⅱ),各級酒精1-2小時。脫水應*,否則材料不能透明,影響石蠟的浸入,致使難以切片。

  4、透明:

  酒精與石蠟不能混和,因此,脫水后的材料在浸蠟前,還必須經過透明。透明劑既可替代組織中的酒精,又能溶解石蠟,以利石蠟的滲入。二甲苯是常用的一種透明劑。

  將脫水后的材料經1:1*與二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ),各級時間為0.5-2小時,務使組織達到透明為止。

  5、浸蠟:

  將已透明的材料移入熔化的石蠟內浸漬即為浸蠟。其目的是去除組織中的透明劑,而使石蠟滲入整個組織,獲得一定的硬度和韌度,以便切成薄的切片。

  先將裝有56-58℃石蠟的三個蠟杯放在熔蠟箱內熔化,并使熔蠟箱的溫度保持恒定(約58℃),切勿太高或太低。 然后將透明了的材料放入蠟杯(Ⅰ)→蠟杯(Ⅱ)→蠟杯(Ⅲ)。浸蠟時間視材料大小而定,一般總的浸蠟時間為2-4小時左右。

  6、包埋:

  將浸蠟后的材料包埋于石蠟中,并使它凝固成蠟塊,這一過程稱為包埋。

  包埋前,視組織塊的大小先將繪圖紙折成一紙盒,作為包埋的容器。紙盒折法如下:先折1、2線,次折3、4線,然后使a、b兩折重疊,向外折出5線;同法折出6線,再折c線。zui后依同法折出7、8線及d線即成。

  將紙盒盛滿已熔化的石蠟,隨即將第三杯中已浸蠟的材料放入其中,應注意切面朝下,位置放正。然后速將紙盒半浸于冷水中,待石蠟表面凝結后,將紙盒全部浸入水中冷卻。石蠟全部凝固后,拆去紙盒即成蠟塊。

  7、切片:

  切片前,先將蠟塊用刀片修整成上下兩邊平行的正方形或長方形,否則切出的

  蠟帶彎曲不直,或無法連成帶狀。

  將修整后的蠟塊粘在小木塊上,小木塊裝在切片機上,以待切片。

  在旋轉式切片機上將蠟塊切成4-8um厚的薄片。切下的薄片連。蠟帶。用毛筆輕輕取下蠟帶,放在蠟帶盒內備用。

  8、貼片或烤片:

  將蠟片粘貼在載玻片上即為貼片。用小玻棒蘸取一點蛋白甘油滴于一干凈的載玻片上,用手指涂勻,并加幾滴蒸餾水于載玻片上。 將蠟帶按要求切成適當長度的蠟片,然后用小鑷子將蠟片輕放在載玻片的水面上,再把載玻片放在展片臺上(溫度為45℃左右)。蠟片受熱后即慢慢展平。待*展平后,用解剖針將切片位置撥正,傾去載玻片上的余水后,將其放在烤片盒中,置于50℃左右 恒溫箱 內烤干。

  9、染色:

  染色劑多為水溶液,故染色前必須先經脫蠟、復水等步驟。染色方法眾多,以H.E.染色法而言有下列步驟:

  ⑴、脫蠟:將烤干的切片放入二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)中,各為5min, 以溶去切片上的石蠟。

  ⑵、復水:是將脫蠟后的切片經各級濃度酒精逐漸下降到水的過程,即將二甲苯(Ⅱ)中取出的切片移入*→95%酒精→80%酒精→70%酒精→蒸餾水,各級中停留1-5min。

  ⑶、染色:

  ①、將蒸餾水洗滌后的切片移入Harris蘇木精液中5-10min,使細胞核著色。

  ②、用自來水洗去切片上殘余的染液。

  ③、用1%鹽酸酒精分色數分鐘。分色時就是褪去細胞質不應著色部分的顏色,而使細胞核著色得清晰適度。分色時需隨時用顯微鏡檢查切片,使分色適度。

  ④、入1%氨水或自來水浸洗,使之藍化。

  ⑤、在蒸餾水中浸片刻。

  ⑥、切片入70%→80%→90%各1-2min。

  ⑦、入0。5%曙紅酒精溶液中染色2-5min,使細胞質著色。

  10、脫水:

  切片依次入95%酒精(Ⅰ)→95%酒精(Ⅱ)→*(Ⅰ)→*(Ⅱ),各級中停留1-5min。

  11、透明:

  切片入1:1*、二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ),各級停留1-5min。

  12、封藏:

  將切片從二甲苯(Ⅱ)中取出,用紙或布擦去材料周圍的二甲苯。在材料中央滴一小滴樹膠,然后,用鑷子加蓋蓋玻片。

  切片封好后,放在切片托盤上待干燥,即可用不觀察。

  染色結果:細胞核呈現鮮艷的藍色,細胞質及細胞間質呈粉紅至紅色。

  (三)、注意事項:

  1、制片是一個連續的操作過程,往往要連續幾天才能完成,因此,事先一定要制訂工作日程計劃,應按順序進行工作。這樣可避免和其它工作發生沖突,也不會因前后順序顛到或超過了規定的時間,給工作帶來不必要的損失。

  2、制片的各個步驟都是互相關聯的,如脫水不*就會影響到透明的程度,以至影響蠟塊的質量。為此,必須對任何一個步驟,都要細致、嚴格進行操作。

  3、通過本實驗可了解到每張切片都是來之不易的,因此,應倍加愛護,不要損壞。